Д.І. Яворницький народився 6 листопада (25 жовтня) 1855 року в селі Сонцівці (нині – Борисівка) Харківської губернії. Освіту Дмитро Яворницький здобув у рідному селі, потім у Харківському повітовому училищі, Харківській духовній семінарії, з якої пішов у 1877 році після 6-го класу і тоді ж склав іспити на історико-філологічний факультет Харківського університету.

На студентські роки припадає початок вивчення ним історії запорізького козацтва, студіювання основних наукових праць з історії України. По закінченні університету 1881 році Д.І. Яворницький був залишений як обдарований студент позаштатним стипендіатом для підготовки до професорського звання на кафедрі російської історії. Згодом він переїжджає до Петербургу, де працює в столичних училищах викладачем історії і продовжує збирати матеріали з історії Запорізької Січі. Там же з’являються його перші друковані праці.

З 1892 по 1895 рр. він працює чиновником з особливих доручень при туркестанському генерал-губернаторові. За плідну роботу з вивчення місцевих старожитностей молодий дослідник був нагороджений орденом Бухарської зірки ІІІ ступеня.

У 1895–1896 роки Д.І. Яворницький працює у варшавських архівах. 1896 році на запрошення В. Ключевського приїздить до Москви і стає доцентом Московського університету, викладає історію українського козацтва. В 1901 році він захистив магістерську дисертацію в Казанському університеті. У 1902 році на запрошення Катеринославського наукового товариства Дмитро Яворницький очолив новостворений Катеринославський історико-краєзнавчий музей, обіймає посаду директора до 1933 року. За час роботи перетворив цей заклад в один із найкращих музеїв України. Поповнюючи його матеріалами власних археологічних та етнографічних експедицій, а також подарованими чи купленими експонатами, створив унікальну колекцію матеріальних пам’яток Запорожжя і Південної України.

Дмитро Яворницький один із перших розпочав систематизоване вивчення історії запорізького козацтва, використовуючи архівний матеріал, пам’ятки археології, народні перекази, відомості топоніміки, розповіді населення. Йому належить фундаментальні праці: «Запорожжя в залишках старовини та переказах народу» (1883), «Збірник матеріалів для історії запорозьких козаків» (1890), «Вольності запорозьких козаків» (1890), «Нариси з історії запорозьких козаків Новоросійського краю» (1890), «Джерела для історії запорозьких козаків» (1903).

Справою всього життя вченого, підсумком шістнадцятирічної праці є тритомна «Історія запорозьких козаків» (1892–1897). У виданні були використані документи з державних і приватних архівів Одеси, Києва, Катеринослава, Харкова, Москви, Петербургу, Архангельська, Соловецького монастиря.

У серпні 1884 року на VI археологічному з’їзді в Одесі колекцію археологічних знахідок Дмитра Яворницького визнано однією з кращих. На цьому ж з’їзді він прочитав два реферати, які викликали інтерес у присутніх і здобули загальне схвалення.

Багато зусиль доклав Дмитро Іванович до підготовки молодих дослідників: у 1920–1933 рр. працював в Інституті народної освіти в Катеринославі, у 1925– 1929 рр. очолював кафедру українознавства, обіймав посаду професора. Як видатному фахівцю з історії України, йому у 1927 році було доручено керувати експедицією з виявлення старожитностей під час будівництва Дніпрогесу.

1920 року Дмитро Яворницький уклав «Словник української мови».

1929 року Д. Яворницький був обраний дійсним членом Академії наук УРСР.

Крім історії Запорожжя Д.І. Яворницький написав історію міста Катеринослава, села Фаліївки-Садової на Херсонщині, видав альбоми «Української старовини» та «Дніпрові дороги», науково-популярне видання «Слідами запорожців», якими започаткував жанр т.зв. краєзнавчої літератури.

Як збирач і колекціонер старожитностей Дмитро Іванович був одним з перших в України організаторів музейної справи, теоретиком-музеєзнавцем, архівістом та археографом, знавцем архівної справи.

Д.І. Яворницькому належить першість відкриття петриківського декоративного розпису, нині відомого в усьому світі. Зразки цього мистецтва завдяки Яворницькому у 1905 році потрапили через археолога та етнографа Федора Вовка до колекції українського розділу етнографічного відділу Російського музею у Петербурзі. А в Катеринославському історичному музеї він зібрав близько тисячі різноманітних узорів цих розписів.

Вчений надавав великого значення виявленню і популяризації талановитих народних співців-кобзарів та розповідачів. Дмитро Іванович відіграв велику роль у житті й творчості багатьох кобзарів, зокрема Пасюги, Кучугури-Кучеренко, Кожушка та ін.

У 1991 році засновано премію імені Дмитра Яворницького Національної спілки краєзнавців України – щорічна краєзнавча премія в Україні. Лауреатів визначає Національна спілка краєзнавців України.